• 最新论文
  • 关于大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 教育部直属高校推进信息公开:寻求治理佳境 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 教育部公示08年度培育资金项目09年度重大项目拟资助项目 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 教育部公示08年度培育资金项目09年度重大项目拟资助项目 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 刘云山登门看望国家最高科技奖获得者 刘云山登门看望国家最高科技奖获得者 南京理工称民工擅入切割废料导致爆炸
  • 推荐论文
  • 关于大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 教育部直属高校推进信息公开:寻求治理佳境 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 教育部公示08年度培育资金项目09年度重大项目拟资助项目 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 教育部公示08年度培育资金项目09年度重大项目拟资助项目 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 官春云、卢光琇获湖南科技杰出贡献奖 新京报社论:消除高校腐败要打破“权力通吃” 刘云山登门看望国家最高科技奖获得者 刘云山登门看望国家最高科技奖获得者 南京理工称民工擅入切割废料导致爆炸
  • 热门标签
  • 日期归档
  • 关于大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建

    来源:www.shuoshisheng.net 发布时间:2020-01-20

    MicroRNA(miRs)是高度保守的非编码RNA,长度为18至24个核苷酸,可通过与mRNA的3'非翻译区结合来调节翻译,并可微调细胞信号传导途径和细胞发育过程。里面的蛋白质。大量研究表明,miR的许多细胞内和细胞外变化与心血管疾病(例如心肌梗塞,心力衰竭,心肌病和心律不齐)相关。近年来,已有文献报道,体内miR含量的变化与心肌缺血再灌注损伤的发生和发展密切相关。但是,miR-22在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中的作用及其调控机制的报道很少。本研究的目的是通过构建和鉴定miR-22腺病毒载体,包装,扩增和纯化腺病毒,获得具有一定滴度的含有miR-22基因的重组腺病毒,并研究miR-22以用于以后的研究。它为心肌缺血再灌注损伤的作用和分子机制奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1大鼠miR-22腺病毒表达载体的构建与鉴定

    现在根据文献,包括化学合成AgeⅠ结束的EcoRI限制性位点(5“端下划线AgeⅠ酶切位点,3” EcoRI限制位点的末端标有下划线)的基因:ACCGGTTCCTCCCCTTCCCTCTAGGAACCTGTGCCTCCCACACGCTCACCTGGCTGAGCCGCAGTAGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTATGTCCTGACCCAGCTAAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTTGCCCTCTGCCACTGGCTTCGAGGAGGAAGAGGAGGAGCAGCTTCTTTGCCTATCATCTGGAAGGTGACAGAACTGGGGTTGGGAAGGTCTGGACAGCTGGGGTGACGGCTTTACAGTTTTTGAATTC(MIR-22)。将获得的靶基因用作模板,进行PCR扩增,并将扩增的产物用AgeI和EcoRI进行双消化。用AgeI和EcoRI双重消化腺病毒载体GV202以使其线性化,并与同样用AgeI和EcoRI消化的目的基因连接。将连接的产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中,并通过酶消化和测序鉴定克隆。鉴定为阳性,测序比对一致。

    1.2腺病毒载体的包装

    用Qiagen的质粒提取试剂盒提取构建的miR-22腺病毒重组质粒DNA和辅助包装质粒pBHGloxδE1,3Cre DNA,并将提取的质粒DNA溶解在灭菌的TE缓冲液中以吸收紫外线。确定质粒的浓度和纯度以确保提取的质粒DNA的A260/A280在1.8至2.0之间。将5μg以上制备的质粒DNA加至无菌离心管中,并与DMEM充分混合,将总体积调节至50μl,并在室温下孵育5分钟。在另一个无菌管中将10μl脂质体2000试剂与50μlDMEM混合,并在室温下孵育5分钟。将稀释的DNA与脂质体2000混合,并在室温下孵育20分钟,以形成DNA和脂质体2000稀释液的转染复合物(此过程不会振荡)。将得到的转染复合体转染到细胞状态良好,传代数少的人胚肾293细胞培养基中,混合,并在5%CO 2细胞培养箱中于37℃培养。 68小时后,弃去含有转染混合物的培养基,加入5ml含10%血清的细胞培养基继续培养,每天观察转染后的细胞生长状态。在显微镜下,如果细胞出现病变,脱落等,则表明腺病毒包装成功。收集富含腺病毒颗粒的人胚胎肾293细胞的上清液,并在-70℃下保存直至使用。

    1.3重组腺病毒的扩增纯化及效价测定

    第一轮扩增:将在T25细胞培养瓶中稀释了4倍的人类胚胎肾293细胞转移到另一个T25细胞培养瓶中,并在37°C的含10%FBS的DMEM中培养。在5%CO2下培养(细胞在以下扩增中使用该条件进行培养)。当细胞达到60%汇合时,弃去培养液,并将2ml复制缺陷型腺病毒重组复制后获得的粗提取物成功加入培养瓶中,并将培养瓶置于细胞培养物中。孵育90分钟,最后放入培养瓶中。加入3 ml完整的培养液,然后继续培养。当大多数细胞表现出典型的细胞病变作用,并且有50%的细胞脱落时,通过低速离心实验收集病毒上清液并保存在-70°C。第二轮扩增:将在优选的T25细胞培养瓶中的所有人类胚胎肾293细胞转移到T75细胞培养瓶中,并进行完全培养。当细胞达到90%融合时,弃去培养液,将2 ml在第一轮扩增中获得的病毒溶液添加到培养瓶中,在细胞培养箱中孵育90分钟,最后添加10 ml完整培养液培养瓶中的溶液。并继续训练。当大多数细胞表现出典型的细胞病变作用,并且有50%的细胞脱落时,通过低速离心实验收集病毒上清液并保存在-70°C。根据Adeno-XTM病毒纯化试剂盒(BD Biosciences,Clontech)的程序纯化通过第二轮扩增获得的重组腺病毒上清液,并用纯化的重组腺病毒感染人胚肾293细胞,并根据终点稀释法。腺病毒滴度值,病毒滴度=10(x + 0.8)单位:PFU/ml,χ=10-110连续稀释的细胞病变的阳性率。

    2个结果

    2.1阳性克隆的鉴定与测序

    miR-22重组阳性克隆的大小为243 bp,结果与预期一致。对重组阳性克隆进行测序,确认合成目标基因链序列已正确插入且无突变。

    2.2腺病毒载体包装结果

    成功构建miR-22重组腺病毒载体和腺病毒包装质粒并共转染人胚肾293细胞10天后,人胚肾293细胞开始脱落。显微镜观察表明,人胚肾293细胞表现出典型的细胞病变作用,提示腺病毒。包装成功。

    2.3重组腺病毒的扩增,纯化及效价测定结果

    在腺病毒的第一轮和第二轮扩增中,大多数人胚胎肾293细胞表现出典型的细胞病变和细胞脱离,满足扩增要求。腺病毒纯化过程顺利进行,纯化的腺病毒保存在-70°C。根据病毒滴度计算公式,获得的腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。

    3讨论

    心肌缺血再灌注后常出现心律失常、梗死面积扩大、持续性室性收缩功能障碍,可能与能量代谢紊乱、氧自由基生成过多、钙超载、细胞凋亡有关。自Jennings等人1960年首次提出心肌缺血再灌注损伤的概念,成为心血管疾病研究领域的热点。缺血再灌注损伤作为影响患者缺血再灌注后心脏结构和功能恢复的主要因素,是困扰临床医生的一大难题。mir广泛存在于真核细胞中,通过降解靶mrna或抑制其翻译来调节细胞的增殖、分化和凋亡。大量研究表明,体内mir的变化与许多心血管疾病的发生发展密切相关,包括心肌缺血再灌注损伤。研究表明,mir-21重组腺病毒转染小鼠缺血再灌注后,可减少心肌梗死面积,减少心肌细胞凋亡,改善左室重构。然而mir-22在心肌缺血再灌注损伤病理过程中的作用却鲜有报道。本研究探讨了mir-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其分子机制,不仅加深了对mir的认识,而且为有效治疗心肌缺血再灌注损伤提供了新的思路。本实验以genechem重组腺病毒载体系统为mir-22的表达载体,将合成的靶基因连接到gv202载体上。经阳性克隆鉴定、病毒包装、扩增、纯化及效价测定,获得实验结果。滴度为1 x 109 pfu/ml的重组腺病毒。

    综上所述,本研究成功构建了大鼠mir-22重组腺病毒表达载体,其病毒滴度达到1×109pfu/ml,所获得的含mir-22基因的重组腺病毒将为以后进一步研究mir-22的作用和分子机制奠定基础。心肌缺血再灌注损伤。

    友情链接: