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  • 关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

    来源:www.shuoshisheng.net 发布时间:2019-10-18

    淋巴系统由广泛的淋巴管网络组成。它的主要功能是收集间隙空间中的液体和蛋白质,并将它们导入循环系统。它也是白细胞和肿瘤细胞的进出口。淋巴管通过将白细胞和抗原从组织引导至淋巴结,在启动免疫应答中起重要作用。因此,淋巴系统在维持组织液平衡,参与肿瘤转移和调节免疫力中起重要作用。淋巴管内皮细胞排列在淋巴系统的腔表面,是构成淋巴管壁的主要结构。近年来,随着人们对淋巴系统的认识加深,淋巴管内皮细胞逐渐成为研究的热点。

    淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞的增殖和扩张形成的良性肿瘤,其发生在舌头,嘴唇,脸颊和颈部。淋巴管瘤通过周围组织的压迫和浸润对组织和器官造成损害。当前,治疗主要是手术,但是存在诸如手术后容易复发的问题。一些学者使用局部注射博来霉素或高渗盐水,但可能引起周围组织的免疫反应或疤痕回缩,从而扩大了原始状况。因此,期望新的治疗方法克服上述治疗方法的缺点。到目前为止,淋巴管瘤的病因尚不清楚。这项研究在体外分离并培养了与淋巴管瘤相关的淋巴管内皮细胞,为研究淋巴管生成在淋巴管瘤复发和淋巴结转移中的作用提供了体外细胞模型。

    1材料与方法

    从GiBCO公司购入1.1种材料M199、DMEM和胎牛血清,购自Sigma公司的胶原酶和Ⅰ型胶原;从圣克鲁斯购买鼠抗人FLT-4单克隆抗体;兔抗人LyVE-1多克隆抗体购自R&;d公司;hrp羊抗兔和hrp羊抗鼠抗体购自北京金桥公司;cultrex bme购自北京金桥公司。从特雷维根公司购买,从bd公司购买vegf-c。淋巴管瘤标本取自武汉大学附属口腔医院。本研究经武汉大学附属口腔医院伦理委员会批准。

    1.2从舌淋巴管瘤标本中分离培养淋巴管内皮细胞,分为两部分。其中以4%多聚甲醛为蜡,另一种置于冰M199培养基(含10 mg/L两性霉素,100 U/ml青霉素,100 mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于细胞分离。取回组织后,用hank's液在超净台上多次冲洗肿瘤周围组织,用剪刀将肿瘤周围组织切除。肿瘤被切成约0.5mm×0.5mm×0.5mm的大小。胶原酶在37%(w/v,胶原酶/无血清dmedm)下消化45-60分钟。消化产物经30mm孔径过滤器过滤,滤液为1200 r/min,离心10分钟后,用hank's液洗涤细胞3次,再次离心。细胞悬浮于egm完全培养基中,移入t 25培养瓶中。细胞在37℃和5%co2培养箱中培养。

    1.3免疫组织化学染色常规将石蜡切片用水脱蜡,在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中切片,在微波中加热5分钟,在室温下冷却,在PBS缓冲液中冲洗5分钟×2次; 50μL过氧化物酶封闭溶液,在室温下孵育15分钟,用PBS缓冲液冲洗5分钟×3次;吸干PBS缓冲液,在37°C下加入50μL正常绵羊血清10分钟,然后不经洗涤除去加入适当稀释的一抗4°C孵育过夜;在PBS缓冲液中冲洗5分钟×3次,在室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗30分钟。用PBS缓冲液冲洗5分钟×3次,加入新鲜的DAB溶液并染色,在显微镜下观察呈阳性。终止为棕黄色(5分钟)。自来水洗涤,苏木精复染5min,1%盐酸乙醇复溶10s。自来水洗涤,1‰氨水浸泡30s;梯度乙醇脱水(每次2min分别为70%,80%,95%和100%),二甲苯透明5分钟,并密封中性胶。

    1.4电子显微镜标本的制备接种后24 h更换淋巴管内皮细胞。 72h用2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.2)固定1小时,然后用刮刀刮去粘附的淋巴内皮细胞,并用固定液转移到离心管中,并离心(2000 r/min) 10分钟沉淀物用1%柠檬酸固定,用梯度乙醇脱水,包埋在树脂中,超薄切片,柠檬酸铅和醋酸铀染色,并在Hitachi H-600透射电子显微镜下观察。

    1.5细胞增殖测定将淋巴管内皮细胞制成细胞悬液进行细胞计数。将1×104细胞接种到200μL含10%胎牛血清DMEM的96孔板中,并在37°C,5%CO 2的培养箱中培养。向每个孔中加入1 g/L MTT溶液,培养4小时,并丢弃MTT溶液。向每个孔中添加DMSO(二甲基亚砜)以停止,摇动15分钟,并通过酶标仪在560 nm下测量A值以绘制曲线。实验重复了三遍。

    1.6体外管形成试验将200μL胶原蛋白(2 g/L)加入24孔板中,并将凝胶在37°C下凝固30分钟;每孔向凝胶表面添加约1×104淋巴管内皮细胞。将细胞在37℃,5%CO 2的培养箱中培养7天,并在倒置显微镜下观察并拍照。将胶原凝胶固定在2.5%戊二醛中,并通过透射电子显微镜观察管腔的超微结构。

    2个结果

    2.1舌淋巴管瘤标本的HE染色和免疫组化染色HE染色结果表明,舌淋巴管瘤组织中有大量扩张和增生的淋巴管,管腔内未见血细胞,少量淡色液体为被视为流明。内有残留淋巴。免疫组织化学染色显示,腔内的内皮细胞被目前公认的淋巴管内皮细胞特异性标记FLT-4和LYVE-1高度表达,与文献一致。因此,可以认为淋巴管瘤为分离淋巴管内皮细胞提供了可靠的标本来源。

    2.2淋巴管内皮细胞的形态和超微结构原代培养的淋巴管内皮细胞生长缓慢,并且单层粘附在壁上。在显微镜下,细胞呈扁平梭形或多边形,大小均一且卵圆形。有核区域比无核区域更加突出,并且在培养14天后,其面积增长到融合的90%。当原代细胞生长到90%融合时,它们开始通过。接种1小时后,淋巴管内皮细胞开始粘附。由多个细胞组成的细胞簇更可能粘附,分裂和增殖。粘附后的细胞是梭形和三角形。呈多边形,类似于原代细胞,但生长速度更快,融合约7d,从传代第二天开始迅速增殖,第六天缓慢增长,反映出内皮细胞生长的独特接触抑制现象;当内皮细胞形成单层后,呈现典型的“铺路石”状外观。中央细胞小而密,周围细胞大且不规则,排列松散,可见一些纺锤形细胞。透射电镜将观察淋巴管内皮细胞的超微结构。细胞排列在鳞状单层中。在显微镜下,大多数细胞聚集。可以看到单元之间的紧密或间隙连接。可以看到内皮细胞特异性颗粒。 Palade尸体;可见内皮细胞的其他细胞器,例如细胞质过程和质膜囊泡。

    2.3淋巴管内皮细胞的体外增殖和管形成实验体外增殖实验表明,淋巴管内皮细胞在第3天开始进入增殖期,在第5天进入高峰,在第6、7天进入平台期。体外管形成实验表明,淋巴管内皮细胞可以在I型胶原蛋白培养基中形成管腔样结构,并且随着培养时间的延长,从不同方向形成的管腔相互连接,形成了类似于血管内皮细胞的复杂三维形状。身体。淋巴网。通过透射电子显微镜观察到管腔状结构的超微结构。观察到被淋巴管内皮细胞包围的内腔。在存在这种细胞外基质成分的情况下,可以看到相邻细胞之间紧密的或镶嵌的重叠连接。淋巴管内皮细胞与体内细胞外基质相互作用的过程。

    3讨论

    淋巴管瘤与淋巴管扩张和异常增殖有关。研究人员如Sironi M在腹膜注射弗氏不完全佐剂时产生淋巴管瘤,然后分离培养获得鼠淋巴管内皮细胞。为了研究淋巴管内皮细胞的生物学特性,它为研究淋巴管生成提供了细胞模型。本文使用的舌头淋巴管瘤标本的病理特征与先前报道的淋巴管瘤病例一致。 HE染色结果显示,该切片有大量扩张的淋巴管,管腔内未见血细胞,但少量嗜曙红细胞被伊红染色。为了进一步确定这些扩张管腔的性质,使用了免疫组织化学染色来检测淋巴管。真皮细胞标志物的表达表明腔内皮细胞表达FLT-4和LYVE-1,证实了淋巴管的性质。因此,舌淋巴管瘤是淋巴管内皮细胞标本的非常有价值的来源。

    本文采用胶原酶消化法分离淋巴管内皮细胞。处理标本时,应注意避免污染肿瘤周围的舌组织细胞,尽可能除去周围组织,并确保分离细胞的纯度。用高浓度抗生素溶液清洗组织表面多次。细菌和真菌。控制胶原酶作用时间是获得高纯度靶细胞的关键。作用时间太短,所获得的细胞少且难以培养。时间过长,可能会导致某些其他细胞的污染。在发现淋巴管内皮细胞特异性标志物之前,研究人员大多使用胶原酶消化来分离细胞。近年来,由于发现了淋巴管内皮细胞标志物,学者们开始使用免疫磁珠从各种组织中分离淋巴管内皮细胞。 Simona Podgrabinska,Ernst Kriehuber和Taija Makinen等人。为了研究从组织中分离出相关亚型的淋巴管内皮细胞的方法,使用了分别用LYVE-1,Podoplanin和VEGFR-3抗体标记的磁珠。实际上,该方法仅分离了一部分淋巴管内皮细胞,并且可能具有其他细胞污染,例如血管内皮细胞,不能完全反映淋巴管内皮细胞的生物学特性。胶原酶的消化还可能引起其他细胞的污染,例如血管内皮细胞,间质细胞等。为了获得更高纯度的淋巴管内皮细胞,该实验利用了内皮细胞相对容易消化的特性,从而使淋巴管内皮细胞与难以消化的污染细胞分离,并在新的培养瓶通过后更换。未消化的细胞;同时,在EGF培养基中加入生长因子VEGF-C,可以选择性增殖淋巴管内皮细胞。据报道,VEGF-C可以选择性地增殖淋巴管内皮细胞而无血管内皮细胞。同时,已有文献报道,在内皮细胞培养基中加入适量的肝素可以增强内皮细胞的生长能力,减少生长因子的量,从而可以长期培养细胞。时间和细胞表型保持不变。因此,在培养基中加入肝素可以最大限度地提高淋巴管内皮细胞的纯度,并保留其在体内的分子表型和生物学特性。

    在倒置显微镜下,淋巴管内皮细胞生长到融合的80%到90%,表现出典型的内皮细胞形态的“铺路石”状外观。传代培养后,在透射电子显微镜下观察收获的细胞。正如文献报道的那样,我们可以看到内皮细胞的特征性韦伯-帕拉德体。在超微切片中,还观察到大量胞质神经突和细胞核。淋巴管内皮细胞的特征细胞器(如膜小泡)也可以看作细胞之间紧密连接和间隙连接。细胞在I型胶原蛋白培养基中形成复杂的腔样网络。透射电子显微镜证实,淋巴管内皮细胞具有在体外形成淋巴样结构的能力,在特征细胞之间重叠,呈细胞间液形式的液体,并且颗粒进入和离开淋巴瓣膜并在电子显微镜下可见。

    该实验表明舌淋巴管瘤提供了淋巴管内皮细胞标本的宝贵来源。体外分离培养的淋巴管内皮细胞为研究淋巴管生成的分子调控机制,治疗淋巴管瘤复发和肿瘤淋巴结转移提供了细胞模型。基础。

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