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  • Calcein-AM/PI双染法与流式细胞术检测γδT细胞毒性结合

    来源:www.shuoshisheng.net 发布时间:2019-11-09

    γδT细胞是一组独特的T淋巴细胞亚群,它们桥接先天性和适应性免疫,占外周淋巴细胞的0.5%至5%,并且在抗感染和抗肿瘤免疫中起着重要作用。最近的研究发现,在难治性前列腺癌,肾癌,非小细胞肺癌,多发性骨髓瘤,转移性黑素瘤,白血病和淋巴瘤的临床治疗中,γδT细胞的总客观应答率为40%。前列腺癌和肾癌的客观缓解率优于二线化疗。尽管它已经取得了良好的临床效果,但是它缺乏准确,简单和经济的方法来评估其杀伤效果。该方法的建立对促进免疫细胞临床应用标准化质量体系的建设具有重要意义。免疫细胞毒性的经典检测方法是51Cr释放法,由于放射性元素的污染,极大地限制了该方法的应用。其他检测方法如MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法具有灵敏度低和操作麻烦的缺点。最近,发现在检测之前,效应细胞被钙黄绿素-AM染色,并且死细胞被碘化丙啶(PI)染色。最后,使用流式细胞仪(FCM)检测细胞。具有与51Cr释放方法相同的精度。但是,经典方法无法区分死细胞的来源:死细胞是源自免疫细胞介导的杀伤还是自然死亡。因此,我们建立并优化了钙黄绿素-AM/PI双标记方法与流式细胞术相结合来检测γδT细胞的杀伤,并解决了上述方法的缺点。

    1材料与方法

    1.1主要试剂和仪器

    Calcein-AM购自Invitrogen,PI,HMBPP购自Sigma,RPMI 1640,胎牛血清(FBS)购自Gibco,重组人IL-2(rhIL-2)购自北京双鹿,硫酸庆大霉素购自人淋巴细胞分离液购自宜昌仁福药业,购自天津宇阳。抗CD3-FITC,抗CD3-PerCP,抗CD4-PE,抗CD8-PE,抗TCRVγ9-PE荧光抗体和Trucount管购自BD。流式细胞仪FACSCanto II和Z2自动细胞测定计数器分别购自BD和Beckman。

    1.2标本来源和γδT细胞培养

    收集外周静脉血,肝素抗凝和生理盐水,并在健康的成年人志愿者中稀释。使用Ficoll密度梯度离心获得外周血单核细胞(PBMC)。洗涤后,将细胞数调整为1×。 106/ml,重悬浮于RPMI 1640完全培养基中,该培养基含有5%FBS,5%人自体血浆和80 IU/ml硫酸庆大霉素。接种在T25烧瓶中,每瓶5ml,同时加入HMBPP和rhIL-2。最终浓度为20 ng/ml。根据细胞生长情况,每2至3天进行一次补液或传代。使用的补液包含300 IU/ml。水合后,rhIL-2的RPMI 1640完全培养基保持在(0.51)×106/ml,并收集细胞直至培养后7-10天。通过以上条件获得了γδT细胞。肿瘤细胞系K562和A549购自中国科学院上海细胞银行,并在5%CO2培养箱中于37°C与含有10%FBS的RPMI 1640培养基一起培养。

    1.3钙黄绿素-AM标记的靶细胞钙黄绿素-AM制备为具有二甲基亚砜(DMSO)的储备溶液(2 mmol/L),分配后储存在-20°C。不同的肿瘤细胞具有不同的染色条件。为了确定染色条件,将处于对数生长期的K562和A549细胞用PBS洗涤两次,并调节至4×106/ml,并加入24孔板中。 ML;将稀释的钙黄绿素-AM以1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078μmol/L的终浓度添加到上述细胞孔中,并且每个梯度设置3个重复孔。然后,在5%CO 2培养箱中于37°C孵育30分钟;孵育后,用含10%FBS的RPMI 1640培养基洗涤两次,以在0,4制备1×105/ml细胞悬浮液,并在24 h机器上检测MFI值。钙黄绿素-AM的固定浓度为0.5μmol/L,调整后的细胞数为5×104/ml,1×105/ml,2×105/ml,4×105/ml,8×105/ml和1.6 ×106 /。 M1,3.2×106/ml,6.4×106/ml,1.28×107/ml,然后根据上述步骤染色,洗涤并检测MFI值。

    1.4细胞收集,PI染色和流式细胞仪的标准程序。钙黄绿素-AM标记的肿瘤细胞和γδT细胞分别以1:10的比例与1×105/ml和1×106/ml的混合物比例制备。将细胞悬浮液以1ml /孔添加至24孔培养板;还设置了一个阴性对照组,其含有1 x 105/ml钙黄绿素-AM标记的肿瘤细胞,每孔1 ml。每组设置三个重复孔,并在37°C 5%CO 2培养箱中孵育30分钟。温育后,将细胞移出并重悬,转移至2ml EP管中,并用PBS洗涤一次。将洗涤溶液转移到相应的EP管中,并用PBS将每个管的体积调节至2ml。将上述细胞悬浮液完全重悬后,将450μl放入新的EP管中,并以5μg/ml的终浓度用PI染色。在黑暗和冰浴中20分钟后,将抗CD3-FITC和抗CD4-PE同种型转移。在绝对计数管中将对照抗体以500μl的体积染色。在机器上,以100μl的固定体积收集计数。

    将calcein-am标记的肿瘤细胞(k562,a549),2*105/ml,0.5ml/孔加入24孔培养板中,根据不同的靶向效应比(5:1,10:1,20:1)将γδt细胞加入上述培养板孔中。最后,使用全rpmi 1640培养基补充至1 ml/孔。阴性对照组为k562和a549细胞,标记1×105/ml钙黄绿素am,体积为1 ml,在37℃的5%co2培养箱中培养24小时。按1.4程序进行细胞采集、pi染色和流式细胞仪检测。最后用flowjo软件对结果进行了分析。γδt细胞的杀伤率计算如下:1-实验组calcein-am单阳性细胞数/对照组calcein-am单阳性细胞数。

    1.6统计分析

    数据采用标准差、t检验、单因素方差分析或简单线性回归分析。p<;0.05认为差异显著。

    2个结果

    2.1分析钙黄绿素AM工作浓度与靶细胞密度的关系。采用流式细胞术检测不同钙黄绿素浓度对肿瘤细胞(k562,a549)平均荧光强度(mfi)的影响。结果表明,不同浓度钙黄绿素am标记的a549和k562细胞均呈现单峰,mfi随钙黄绿素am浓度的增加而增加。进一步的简单线性回归分析表明a549和k562的mfi与calein-am浓度呈正相关(r2=0.9710,p<;0.0001)。在此基础上,进一步探讨钙黄绿素标记的肿瘤细胞与细胞密度的关系。钙黄绿素AM的工作浓度为0.5μmol/L,以K562为例,设置K562细胞数分别为5*104/ml、1*105/ml、2*105/ml、4*105/ml、8*105/ml、1.6*106/ml、3.2*106/ml、6.4*106/ml和1.28*107/ml。结果表明,calcein-am对k562不同细胞数也呈单峰,但mfi随k562密度的增加而降低。简单线性回归分析表明,mfi与k562密度呈负相关(r2=0.4767,p<;0.0001)。

    2.2靶细胞平均荧光强度时间动力学变化特征分析。为了研究钙黄绿素标记的k562 mfi是否随时间变化,分别用流式细胞仪检测k562染色0、4和24小时。结果表明,随着染色时间的延长,mfi逐渐降低,三组间差异有显著性(p<;0.001)。此外,我们还检测了钙黄绿素am染色对细胞活力的影响,并用pi法检测了实验组和对照组的细胞死亡率。结果表明,两组死亡率无显著性差异(p>0.05)。

    2.3在流式细胞仪计数准确性和稳定性分析的基础上,用抗cd3-percp和cd4-pe的同源对照抗体对标准磁珠进行染色。绝对计数管的原理是已知计数管的珠子数。当样品体积固定时,可以知道珠子的浓度。流型可以记录颗粒的数量。采样后,机器根据颗粒数量计算体积,再计算样品浓度,进一步验证了对流收集电池过程的稳定性和准确性。结果表明,标准磁珠组与钙黄绿素标记活细胞组比较,差异无显著性(±208vs 47 150,p=0.324>;0.05)。同时,实验组与对照组在孵育30min后calcein-am标记的肿瘤细胞绝对数无显著性差异(98 642 876 vs 98 692 769,p=0.698 7>;0.05)。

    检测2.4个γδt细胞对calein-am标记靶细胞的杀伤作用。利用上述优化条件,我们评价了不同有效靶比下γδt细胞与k562和a549细胞孵育24小时的杀伤活性。结果表明,当有效靶比为5:1、10:1和20:1时,k562的杀伤率分别为0.63(+0.02)、0.84(+0.02)和0.91(+0.02)。与5:1组相比,10:1组和20:1组的致死率显著增加(P<;0.01),但10:1组和20:1组之间没有显著差异(图4);A549组的致死率分别为0.38(+0.02)。10:1组和20:1组的杀灭率均显著高于5:1组(p<;0.01),但10:1组和20:1组之间无显著性差异。由于不同肿瘤细胞对γδt的杀伤效果不同,从以上结果来看,血肿的杀伤率高于实体瘤。

    3讨论

    近年来,基于免疫细胞的肿瘤免疫疗法在临床应用中取得了长足的进步。如何以简单的方式准确评估其细胞毒活性对于构建免疫细胞质量测试标准化系统非常重要。确定免疫细胞杀伤活性的最经典方法是51Cr释放法。该方法准确且可重复,但存在许多缺陷,例如51Cr本身受到放射性污染,自发释放率高以及固有缺陷(例如检测大量免疫细胞),限制了其应用。目前,已经产生了许多释放51Cr的替代方法,并且基于流式细胞术的Calcein-AM/PI双重染色方法取得了良好的效果。 Jang等报道,通过钙黄绿素-AM染色检测NK细胞的细胞毒性活性,并在流动检测之前用PI染色。结果类似于51Cr释放测定的结果。该方法直接通过总靶细胞中死细胞的百分比来计算杀伤效果,并且无法区分死细胞是自然死亡还是NK细胞介导的杀伤死亡。因此,该方法仍然有一定的局限性。

    本研究通过基于流式细胞仪的钙黄绿素-AM/PI双重染色成功建立并优化了γδT细胞的杀伤作用。选择K562和A549作为靶细胞,我们首先确定钙黄绿素-AM的工作浓度和靶细胞的密度。在0.1-0.5μmol/L的浓度范围内有良好的线性关系。当浓度为0.5μmol/L时,靶细胞具有更大范围的密度选择。因此,该实验为钙黄绿素-AM在不同密度靶细胞染色中的应用提供了参考。然后研究靶细胞MFI的时间以及钙黄绿素-AM对靶细胞存活的影响,发现MFI随时间降低,染料本身对细胞存活无明显影响,这与以前的报道一致[ 16、19]。同时,这项研究还发现,通过优化染料浓度和目标细胞密度,可以在染色24小时后将其与未染色的细胞区分开,并且在Cholujova和其他染色后需要34小时进行检测,并且时间大大延长了[19]。因此,通过优化方案,可以将效应靶细胞的共孵育时间延长至24h,从而更有效地反映效应细胞对靶细胞的杀伤作用。此外,BD绝对计数管验证了流动操作过程的稳定性和准确性。绝对计数管的原理是:根据计数管中已知珠子的数量,在固定样品量时就可以知道珠子的浓度。流类型可以记录池中的粒子数。装载后,机器根据颗粒的数量和体积计算样品的浓度,并进一步验证流量收集过程的稳定性和计数的准确性。在该实验中,染色后30分钟测量肿瘤细胞计数,因为在30分钟时细胞与细胞良好粘附,并且未显示出对靶细胞的杀伤作用。因此,可以在更长的时间内很好地模拟靶细胞的粘附状态,从而更好地验证收集,PI染色和上流操作的过程。

    最后,在上述优化条件下,研究了诱导培养后第10天γδT细胞对K562和A549细胞的杀伤作用。 γδT细胞是主要由HMBPP和rhIL-2诱导的PBMC培养的一组Vγ9Vδ2T细胞,其增殖高达1000倍(数据未显示)。流量检测后,首先计算目标细胞存活率,然后通过“ 1-存活率”方法间接计算杀灭率。结果发现,总的肿瘤细胞在24 h内具有不同的杀伤效率,而对于K562细胞,当目标比例为5:1时,可以看到明显的杀伤效果。在10:1时,杀伤率高达90%,而对于A549细胞,当有效靶比为5:1时,杀伤率为38%。 10:1、20:1分别是杀戮量的50%和60%(图4、5)。因此,我们建立了γδT细胞培养方案的高效扩增和高细胞毒活性。该方法可用于检测其细胞毒活性。由于控制方法消除了反应过程中的天然死细胞,因此反映γδT细胞的细胞毒活性更为现实。同时,由于国内条件的限制和用于比较分析的51Cr释放方法的限制,只能在整个检查过程的验证基础上建立。

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