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  • 五聚体重组多肽疫苗的构建及其抗肿瘤活性研究

    来源:www.shuoshisheng.net 发布时间:2019-11-05

    尽管分子靶向药物可以消除一些肿瘤细胞并为癌症患者带来益处,但它们无法实现终生治愈。这是因为肿瘤引起的免疫抑制可促进肿瘤生长,侵袭和远处转移,并限制了人体的抗肿瘤免疫力。响应的关键因素。肿瘤免疫抑制机制包括抑制性受体配体[programmeddeath-1(PD-1)和programmeddeathligand-1(PD-L1)等],免疫抑制细胞因子[interleukin10(IL-10)和transforminggrowthfactor-β](TGF) -β)等]和肿瘤免疫抑制细胞[髓样来源的抑制细胞(MDSC),调节性T细胞(Tregs)和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)等]。 MDSC是衍生自未成熟的骨髓的各种细胞群体的总称,包括骨髓前体细胞,未成熟的粒细胞,单核巨噬细胞和树突状细胞。它对T细胞有很强的抑制作用。 MDSC约占髓样细胞的1%至5%,其中约1/3可在细胞因子的刺激下分化为成熟的髓样细胞,这在调节免疫系统的正常功能中起着重要作用。然而,在诸如癌症的疾病中,未成熟骨髓细胞的正常分化途径受到干扰,导致大量的MDSC病理状况。 MDSC可以通过多种机制影响先天性免疫应答和适应性免疫应答,包括抑制NK细胞的细胞毒活性,抑制树突状细胞(DC)和巨噬细胞的分化以及诱导Treg细胞的产生和扩增。增加。 MDSC还通过上调精氨酸酶,一氧化氮合酶和活性氧的表达来抑制CD8 + T淋巴细胞的功能。因此,阻断MDSC的形成并减少MDSC涉及的肿瘤免疫抑制可能成为增强机体抗肿瘤免疫应答的有效手段。

    小鼠外周血中的MDSC根据表面标记可分为两个不同的细胞亚群,一个是CD11b + Ly6G-Ly6Chi,具有单核细胞的形态,称为M-MDSC,另一个是CD11b +细胞的A亚群具有粒细胞形态的Ly6G + Ly6Clow被称为G-MDSC。脾脏主要是单核来源的MDSC。 MDSC还带有与其他髓样来源的细胞相同的表面标记。这些标志物缺乏特异性,使得难以使用单个标志物将MDSC与其他髓样来源的免疫细胞(例如巨噬细胞和DC)一起靶向。区分这些标记物也不适合作为肿瘤治疗的靶标。在2014年,Qin等人设计了一种肽体,以完全消除荷瘤小鼠两个亚组中的MDSC细胞。他们的研究发现,该肽体可以对MDSC细胞表面的S100A8蛋白起作用。这项研究表明S100A8可用作MDSC。候选治疗对象。 S100A8属于钙结合蛋白S100蛋白家族,在髓样细胞(如粒细胞和单核细胞)中表达。在与炎症和各种癌症(例如胃癌和食道癌)有关的病理状态下,S100A8显示出明显的上调表达。最近的研究还表明,S100A8在肿瘤部位MDSC的产生和募集中起着非常重要的作用。在正常条件下,S100A8和其他S100蛋白家族蛋白是细胞内蛋白。但是,在炎症和肿瘤的刺激下,MDSC能够将S100A8作为炎症信号释放到细胞外区域。因此,S100A8可用作靶向药物设计的肿瘤诱导的MDSC细胞表面标记。胆囊毒素(CT)由A亚基(CTA)和五聚体B亚基(CTB)组成,后者与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂GM1特异性结合,并促进其抗原蛋白与粘膜屏障连接并增强抗原呈递细胞(例如DC)的抗原呈递。因此,CTB是良好的载体蛋白。

    本文以CTB为载体构建了五聚体CTB-S100A8多肽疫苗。该疫苗在4T1小鼠乳腺癌肿瘤模型中显示出显着的抗肿瘤保护作用,该模型产生的抗体可消除肿瘤诱导的MDSC,并且对人体固有的髓样来源的细胞(例如DC和巨噬细胞)没有明显影响。影响,这项研究表明,消除MDSC是对抗肿瘤的有效方法。

    材料和方法

    质粒,菌株和试剂大肠杆菌分泌的表达载体pCTB2(将CTB基因加载到pSJF2载体中形成pCTB2质粒)和表达菌株TG1由江苏省中医学院细胞与分子生物学实验室的曹鹏博士捐赠;质粒pET28a-S100A8(上海杰瑞生物工程有限公司)。由我们的实验室,EcoliTop10感受态细胞,EcoliBL21(DE3)感受态细胞和DNA分子量标准(Tiangen Biochemical Company)制备并保存了EcoliTG1感受态细胞。蛋白质分子量标准(Thermo)。 ClonExpress II一步克隆试剂盒(Vazyme); BspEI和BamHI核酸内切酶(NEB)。酪蛋白水解物(Fluka);凝胶回收和质粒提取试剂盒(Axygen)。流式细胞仪CD11b-FITC,Gr-1-APC,F4/80,CD11c-PE,CD86-FITC和FcγRIII/II(BD公司),其他试剂均为国产或进口分析试剂。

    实验动物和细胞系SPF级6周龄雌性BALB/c小鼠购自上海实验动物中心,体重(20±1)g,许可号: SCXK(Shanghai)2012-0002。给小鼠喂食标准的啮齿动物饮食,并严格按照《实验动物管理条例》进行所有相关的动物实验。小鼠乳腺癌4T1细胞系购自中国科学院上海细胞银行,接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,并于37°C,5%CO 2的培养箱中培养。引物设计和基因合成上海杰瑞生物工程有限公司合成了S100A8(基因序列号P)序列,并加载到pET28a载体中。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物序列如表1所示。

    以pET28a-S100A8为模板,以S100A8-F/R为引物构建重组表达载体,扩增出S100A8(267bp)片段。在95°C预变性3min,在95°C变性30s,在60°C退火30s和68°C的条件下,反应体系为50μL。扩展25s,共35个循环,并最终在68°C下延伸5分钟。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(120V,25分钟),并根据Axygen Gel Recovery Kit的标准操作回收。将pCTB2质粒用BamHI和BspEI内切核酸酶线性化,然后对消化的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(120 V,25分钟),并根据Axygen Gel Recovery Kit的标准操作进行回收。通过同源重组将PCR所得的S100A8片段整合到BamHI和BspEI限制性酶切位点之间的线性质粒pCTB2中(20μL反应系统,含2μLExnaseTmII,4μL5×CEII缓冲液,线性化质粒50-200 ng和插入)。扩增产物为20-200 ng,反应体系小于20μL,以ddH2O补足。将所有组分轻轻混合,在37°C下孵育30分钟,然后立即置于冰上5分钟使用)。

    将反应溶液添加到50μL的EcoliTop10细胞中。将细胞在冰浴中在42℃下加热30分钟,持续90秒。将细胞立即置于冰上5分钟。然后将LB非抗性培养基添加至600μL,在37℃和180r.min-1下振摇并复苏1小时。 300μL用LB固体板(Amp100 ug.mL-1)包被。将细胞在37℃下培养过夜,并选择单克隆培养物。通过PCR鉴定为阳性的单克隆(如前)被送至南京金斯利生物技术有限公司进行测序。正确的CTB-S100A8质粒用作模板,Mutation-F/R用作引物进行PCR扩增。 CTB和S100A8之间的接头已突变。聚合酶链反应(PCR)的反应体系为50μL,条件是在95℃预变性5分钟,在95℃变性1分钟,在55℃退火1分钟,在68℃延伸5分钟。进行35个循环,最后一次延伸至68。用1%琼脂糖凝胶电泳(120V,25分钟)检测PCR产物,并根据Axygen gel Recovery Kit的标准操作进行回收。 DPNI消化胶回收产品(反应系统:50 u L 0 x 1778 DPNI酶1 uL,10 x NEB缓冲液45 u L,总体积少于50 u L,并添加ddH 2;在37 C孵育120分钟,变性在80 C下待机20分钟)。通过取消2 ugL化学溶液,将EcoliTop 10感受态细胞转化为EcoliTop 10细胞。反应体系和条件如前。选择在转化板上生长的单克隆,并在3mLLB(Amp100ug.mL-1)培养基中培养。将细胞在37℃和180R.min-1下摇动过夜。将过夜的细菌送至南京金斯利生物技术有限公司进行测序。重组质粒命名为pCTB2-S100A8。

    重组蛋白的诱导表达:1μLpCTB2和正确测序的pCTB2-S100A8质粒,添加到50μLEcoliTG1感受态细胞中,在42°C加热30分钟,立即置于冰上5分钟,然后添加到LB中没有抵抗。摇动600μL培养基,并在37°C,180 rmin-1下摇动1 h,然后取300μL包被的LB固体平板,并在37°C下培养过夜,直至单克隆生长。在25mL的LB培养基(Amp100μgmL-1)中收集单克隆抗体,并在摇动下在37℃,180rmin-1下培养过夜。将过夜的细菌以1:500的比例转移至1LM9培养基(Amp 100μgmL-1),在28°C,200 rmin-1摇动30小时,然后加入100μL的1molL-1IPTG和加入100mL的10×TB培养基,28在室温,200rmin-1下培养细胞65-70小时,在室温下以8000rmin-1离心5分钟,称重。

    重组蛋白的纯化将每1 g细胞充分重悬于10 mL上样缓冲液(500mmolL-1NaCl,20mmolL-1Tris,20mmolL-1咪唑,pH 8.0)中,悬浮液被超声仪破坏(功率8%至10%,30分钟)。在4℃,rmin-1下离心30分钟后,取上清液使用。镍柱平衡(500mmolL-1NaCl,20mmolL-1Tris,20mmolL-1咪唑,pH 8.0),然后以2 mLmin-1的流速上样,混合蛋白洗脱液(500mmolL-1NaCl,20 mmol)L-1Tris,50mmolL-1咪唑,pH 8.0)洗涤20倍柱体积,洗涤目标蛋白质洗脱液(500mmolL-1NaCl,20 mmol L-1 Tris,500mmolL-1咪唑,pH 8.0)取下并收集洗脱峰。用10mmolL-1 PBS(pH 7.4)平衡G25分子筛后,使洗脱峰通过G25分子筛,并收集流动峰。使用3kDa超滤管进行超滤,使其流过色谱峰,并添加还原/未还原的上样缓冲液以进行SDS-PAGE电泳(分离凝胶浓度为12%,电压为120V,电泳时间约为80分钟,制备蛋白凝胶和运行缓冲液的方法参考Bio -Rad标准配方),BCA定量检测蛋白质的纯度和浓度。

    单结构域蛋白的表达和纯化将1μLpET28a-S100A8质粒添加到50μLEcoliBL21(DE3)感受态细胞中,并通过热激法转化。程序如前所述,将300μL转化子应用于Amp板(Amp100μgmL-1)。在37°C下孵育过夜,直至单克隆生长。在3mL的LB(Amp100μgmL -1)培养基中收集单克隆,并在37℃,200rmin-1下振荡过夜。将过夜的细菌以1:500的浓度转移至1 L的LB培养基(Amp 100μgmL-1)中,在37°C,200 rmin-1的条件下振摇,直到OD600在0.6和0.8之间以及1molL加入-1 IPTG 1 mL。20℃,180rmin-1摇动培养20h。通过在室温下以8000 rmin-1离心5分钟收集细胞,并称重。将每1 g细胞充分重悬于20 mL上样缓冲液中,并用超声仪破坏悬浮液(功率1%,20分钟)。在4℃,rmin-1下离心30分钟后,取上清液使用。纯化镍柱后,洗脱峰用G25分子筛脱盐。脱盐后,用3 kDa超滤管对流动峰进行超滤。通过SDS-PAGE电泳和BCA定量测定蛋白质浓度和纯度。操作方法与以前相同。

    将30只balb/c免疫balb/c小鼠随机分为5组:pbs组、alumiunhydroxide(alum)佐剂组、ctb组、s100a8组和ctb-s100a8组。第0天和第12天进行皮下免疫。剂量为50微克(400微克升)抗原/大鼠/次。各组均采用盐酸阿明325ug((20g)-1。第17天采集眼眶静脉血。在室温下保存2小时,直到血浆沉淀和血清沉淀。血清在4℃下于4000r min-1离心20分钟。血清于-70℃保存,第20天接种4T1肿瘤细胞,剂量为1×105(用PBS稀释至100ml,10mmol L-1 pH7.0)。第3次皮下免疫于25日进行。剂量法和以前一样,肿瘤抑制率计算如下:=[1-(治疗组当天肿瘤体积治疗组第一天肿瘤体积)/(明矾佐剂对照组当天肿瘤体积明矾佐剂第一天肿瘤体积对照组)]*100%。接种后第7天每隔2天测量肿瘤大小。于第49天采集肿瘤和血样,测定小鼠肿瘤重量和体重。所有统计数据用graphpad prism 5.0软件进行分析和绘图。本实验采用t检验分析数据差异的显著性,p<;0.05有显著性差异。

    血清抗体浓度的ELISA分析将S100A8单域蛋白用50mmolL-1碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至10μgmL-1,包被在96孔培养皿中,每孔100μL,并于4℃孵育℃过夜。用0.1%PBST洗涤6次,将3%BSA在37°C下封闭2小时,用0.1%PBST洗涤6次,将血清在封闭溶液中以1:100稀释,并将每孔100μL在4°C下孵育过夜C。用0.1%PBST洗涤6次,用封闭液稀释HRP-兔抗小鼠IgG 1:5000,每孔孵育100μL,在37°C孵育1 h,用0.1%PBST洗涤12次,并形成TMB/H2O2在室温下2摩尔/分钟,持续20分钟。反应以100μLL-1硫酸终止。通过双波长法在酶标仪上读取OD450和OD630的数据。实验组血清OD450-OD630比正常组大2.1倍,抗体呈阳性。

    通过ELISA确定血清抗体滴度。取各组之间OD450-OD630读数的样品的抗体滴度。 S100A8如上进行涂层,清洗和封闭。用封闭液按以下倍数稀释血清: 100×20、100×21、100×22、100×210、100μL/孔,并在4°C下孵育过夜。以与上述相同的方式温育,洗涤和显影二抗。通过双波长法在酶标仪上读取OD450和OD630的数据,并根据OD450-OD630的读数计算各组的抗体效价。

    在第17天和第49天使用流式细胞仪检测细胞含量。将小鼠的脾脏与超干净的桌子分开。将脾脏放入含有10 mmol L-1 PBS(pH7.4)2mL的皿中。将无菌镊子压碎。通过细胞筛过滤细胞悬浮液。将过滤的脾细胞悬液在1500r min-1下离心5分钟。将PBS悬浮液洗涤两次,并再次洗涤外周血。直接离心。将脾细胞悬液和外周血细胞与细胞体积的3-5倍的红细胞裂解液混合,轻轻打打并混合,并在室温下裂解1-2分钟。在4℃和2000r min-1下离心5分钟后,弃去上清液。离心后,将细胞沉淀物用适量的PBS悬浮并洗涤两次。

    将制备的细胞重新悬浮在流动缓冲液中,并稀释至每毫升5 x 106个细胞。将细胞分为两组并通过流式细胞仪染色。将细胞悬浮液添加到每个分支管中。将细胞分组如下:1 CD11b-FITC,Gr-1-APC,F4/80; 2. CD11c-PE,CD86-FITC。将1μLFcγRIII/II抗体添加到每个试管中,轻轻混合并在冰上孵育10分钟,然后将2mL PBS添加到每个试管中并洗涤两次。流动缓冲液用于悬浮细胞。将相应的荧光标记的抗体添加到每个流量管中。然后将每个试管在没有光照的情况下孵育30分钟。如上洗涤细胞两次。最后,加入500μL流动缓冲液。细胞完全悬浮并在计算机上检测到。在该实验中,单向方差分析(非参数)和Tukey检验用于统计,P&lt; 0.05显示出显着差异。

    结果

    1CTB-S100A8表达载体的构建

    构建重组CTB-S100A8表达质粒,接头序列为GGGS,长度为20个氨基酸残基。 pelBleader序列可以引导重组蛋白分泌到大肠杆菌的周质腔中。 His6-标签序列是蛋白质纯化标签。 S100A8的PCR片段的大小为267bp。此外,将重组质粒pCTB2-S100A8用作模板以设计用于PCR扩增的接头突变引物。重组质粒的大小约为4000bp。使用扩增的S100A8的引物通过菌落PCR鉴定重组pCTB2-S100A8。在选择的四个克隆中,克隆1、3和4扩增了S100A8片段作为阳性克隆。测序结果表明,三个阳性克隆的序列符合预期。

    2蛋白质的表达与纯化

    将表达载体转化到BL21菌株中,并通过与Ni柱的亲和力进行纯化。获得了约12kDa的S100A8的单结构域蛋白。通过SDS-PAGE电泳,该蛋白质的纯度大于90%。培养CTB和CTB-S100A8并在TG1的宿主菌株中表达。通过Ni柱亲和纯化,重组蛋白的纯度大于90%。使用变性的还原缓冲液和变性的非还原缓冲液,使用SDS-PAGE检测重组蛋白是否具有聚合物形态。结果表明,亲和纯化后CTB蛋白可形成五聚体。当CTB与S100A8融合时,重组蛋白仍可以保持五聚体形成的特征。

    3抗血清分析

    用S100A8单结构蛋白包封后,将血清进行第二次免疫后作为ELISA测定的抗体。elisa结果显示,s100a8组和ctb-s100a8组均产生了一致的s100a8阳性抗体。测定各组抗体滴度。结果表明,ctb免疫组ctb-s100a8抗体滴度高达8倍,s100a8单域组为16倍。结果表明,五聚ctb能增加抗原大小,增强免疫应答,是一种良好的多肽疫苗载体蛋白。

    4ctb-s100a8对肿瘤的保护(预防)作用

    免疫、取样和接种肿瘤,如图4a所示,CTB-S100A8免疫小鼠肿瘤平均重量为1.88g,明显低于CTB组(P<;0.001)和明矾佐剂组(P<;0.05)。提示ctb-s100a8对肿瘤有明显的保护作用。接种后21d,各组肿瘤大小差异有显著性。佐剂对照组ctb-s100a8接种15d后抑瘤率达50%。21天时,ctb-s100a8组抑瘤率接近60%。

    5CTB-S100A8对部分骨髓来源免疫细胞的影响

    在第二次免疫后第5天,取小鼠外周血和脾白细胞,用流式细胞仪分析主要髓系免疫细胞的变化。结果表明,免疫组对小鼠脾脏及外周血dc、巨噬细胞及mdsc亚群无明显影响(p>;0.05)。

    6ctb-s100a8对肿瘤诱导mdsc的影响

    小鼠外周血中有两种mdsc,脾脏中只有一种。采用流式细胞术检测4T1荷瘤小鼠脾脏和外周血中多药耐药细胞的数量。如图6所示,ctbs100a8免疫小鼠外周血肿瘤诱导的mmdsc数量明显减少(p<;0.05),而g-mdsc数量无明显变化。脾脏mdsc数量无明显变化。

    关于

    mdsc是最重要的肿瘤诱导免疫抑制细胞之一。mdsc表面精氨酸酶和一氧化氮合酶的高表达在许多方面影响t细胞的活化,包括降低tcrcd3_链的表达:阻断细胞周期蛋白d3和细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)的上调。mdsc与t细胞直接接触时,产生的过氧亚硝酸盐可导致tcr和cd8分子的硝化作用,改变其分子结构,使t细胞对特异性抗原刺激无反应。

    因此,MDSC的存在是诸如抗肿瘤疫苗等疗法无法引起免疫反应的重要原因。尽管诸如吉西他滨之类的化学治疗药物在动物模型中对脾脏中的MDSC显示出一定的抑制作用,但由于MDSC中缺乏特定的细胞表面标记,目前还没有针对MDSC的药物或单克隆抗体。 CTB能够形成非共价五聚体。五聚体能够与粘膜层的GM1受体结合,从而引起强烈的免疫应答。因此,它是良好的疫苗载体蛋白或佐剂。在本文中,我们使用融合表达技术设计了针对S100A8的多肽疫苗CTB-S100A8。重组多肽疫苗保留了CTB形成五聚体的特性,可以有效破坏BALB/c小鼠的自身免疫耐受性。产生了高滴度的针对S100A8的抗体。这表明与CTB的融合显着增强了S100A9的免疫原性。该多肽疫苗在带有4T1乳腺癌的小鼠模型中具有显着的肿瘤保护作用,同时,它还利用几种髓样来源的免疫细胞(例如M-MDSC,G-MDSC,DC和巨噬细胞等没有明显作用。在荷瘤小鼠中,CTB-S100A8免疫组的M-MDSC含量明显低于其他组。这可能是由于在髓样前体细胞正常分化为DC或巨噬细胞期间S100A8表达下调,并且肿瘤分泌的细胞因子促进了髓样前体细胞中STAT-3途径依赖性S100A8。该表达上调,导致大量MDSC募集。

    另外,在炎症和肿瘤的刺激下,MDSC可以将S100A8/S100A9细胞内蛋白释放到细胞外结构域,成为细胞表面标志物并被抗体识别。这项研究表明,通过重组疫苗技术消除荷瘤小鼠中的肿瘤诱导的MDSC将是一种有效的抗肿瘤途径。该研究可为针对肿瘤免疫环境的疫苗设计提供参考。

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