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  • 供者型CIK细胞输注对清除异基因造血干细胞移植后微小残留病灶的功效

    来源:www.shuoshisheng.net 发布时间:2019-11-03

    同种异体干细胞移植(allo-HSCT)是治愈血液系统恶性肿瘤的一种手段。但是,复发仍然是移植失败的主要原因。此外,复发和难治性病例疗效差且死亡率高,这仍然是临床实践中的难题。移植后密切监测最小残留疾病(MRD)可以及早发现疾病复发,并可以通过减少免疫抑制剂或供体淋巴细胞输注来减少分子生物学缓解。然而,低的治疗后反应率和急性移植物抗宿主病(aGVHD)是治疗失败的主要原因。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一组以CD3 + CD56 + T细胞为主要效应细胞的异种细胞,通过非特异性免疫杀伤可以消除肿瘤患者的微小残留病变。传统的DLI效果不理想。国内外已经报道了同种异体-HSCT联合供体CIK细胞治疗复发性和难治性血液系统肿瘤。在本研究中,经免疫抑制剂,化学疗法,供体淋巴细胞输注等治疗后,有10例在异基因造血干细胞移植后发生分子生物学复发(7例),在形态学缓解后发生了形态学复发(3例)。但是,MRD阳性的患者用供体型CIK细胞输血并研究了安全性和有效性。

    1材料与方法

    1. 1个案例数据

    我们从2012年11月至2015年11月收集了10例患者,其中9例男性和1例女性,中位年龄为24. 5(10至41)岁。急性淋巴细胞白血病5例,急性髓细胞白血病4例,慢性粒细胞白血病1例。移植前有6例复发或完全缓解(CR),有4例CR(2例CR1,2例CR2)。

    1. 2移植方法

    9例为清髓性骨髓+外周血同种异体造血干细胞移植,其中1例为清髓性非血液移植。单倍体移植6例,同种异体纯合移植2例,同胞7/10的1例,非脐带血1例。急性淋巴细胞白血病患者的预处理方案为TBI/Cy: TBI + CTX + ATG。急性髓性白血病和慢性粒细胞性单核细胞白血病的预处理方案修改为Bu/Cy: Bu + CTX + Ara-C + ATG。

    1. 3移植后的复发与治疗

    移植后每月进行一次骨髓形态学和活检,并通过流式细胞仪或PCR监测MRD。通过减少免疫抑制剂或输注供体淋巴细胞(DLI)来治疗分子生物学复发。患有骨髓形态学复发的患者接受免疫抑制,免疫抑制,化学疗法,化学疗法+ DLI治疗,并在治疗后评估治疗效果。形态缓解但仍MRD阳性的患者接受CIK治疗。

    1. 4 CIK细胞的收集,扩增和检测

    从80至120mL收集供体外周血单核细胞悬浮液,并且脐带血移植患者收集移植患者的外周血(完全植入的供体类型)。分离和洗涤后,将细胞密度调节至1×106/L,转移至培养瓶中,在37°C下添加适量的RPMI1640培养基,自体血浆和细胞因子IL-2,IFN-γ,OKT3进入细胞悬液在5%CO 2条件下进行悬浮培养,并在培养的第4、7、10和13天调节细胞密度,补充IL-2,并同时进行细胞表型分析。培养完成后,流式细胞仪通过检测细胞的表面标志物来识别CIK细胞的表型。并在返回信元之前对CIK信元进行计数;同时执行细菌和真菌学测试。

    1. 5个CIK单元格返回

    从培养基中收集CIK细胞并制成细胞悬液。在6小时内将细胞返回,并且输注时间为约30分钟。在再输注过程中进行CIK细胞表型鉴定,细胞活力测定和细胞计数。在培养的第10至14天通过静脉途径将其返回。

    1. 6不良反应及疗效观察

    所有患者均在治疗前常规检查血液常规,肝肾功能和心电图。治疗期间密切监测心率,血压和血氧饱和度,发烧期间进行物理降温。每月进行血液常规,肝肾功能和最小残留病变,骨髓形态学和活检的治疗。

    2个结果

    2. 1移植后的复发与治疗

    10例患者中大多数原发疾病均复发且难治。所有患者移植后均达到血液学和分子生物学上的缓解。定期监测MRD。 7例发生分子生物学复发,DLI或免疫抑制治疗后MRD仍为阳性。 3例发生形态学复发,其中1例复发时胃肠道GVHD明显,停用免疫抑制剂后原始粒细胞从10.5%下降至4%,无需进一步化疗和DLI治疗即可达到形态学缓解。其他2例接受化学疗法,化学疗法+ DLI并完全缓解,但3例MRD阳性。 CIK治疗前,所有患者均已完全缓解,但MRD为阳性。

    2.2细胞表型检测与CIK细胞计数

    流式细胞仪显示,输注前CIK细胞的表面标记为(90.4 +7.0)%CD3 +,(71.2 +6.6)%CD3 + CD8 +,(18.1 +5.8)%CD3 + CD56 +,(72.3 +7.2)% CD3 + CD56-,(5.5 +4.4)%CD3-CD56 +(10个供体的平均值)。在10名患者中,来自不同供体的CIK细胞被输血2至8次,平均每月输注1次。回输的CIK细胞数为(1.35-7.23)* 109/kg,回输的CIK细胞中位数为(4.32 + 1.73)* 109/kg。

    2.3 CIK输注的不良反应

    两名患者出现输液热,发生在输液后3小时和4小时。体温分别为38.7°C和39.3°C 4小时,并通过物理冷却和退热剂冷却身体。 3 d,无重复。 4例患者出现了I级皮肤和粘膜aGVHD,发生在第二次输注后,并由常规抗GVHD治疗控制。一名患者在输注4次后出现了i级皮肤aGVHD,并受到了免疫抑制剂的控制。 MRD当时是积极的。再次降低免疫抑制剂后,MRD变为阴性,但出现静脉皮肤,肝脏和消化道GVHD。最终死亡。

    2. 4 CIK细胞治疗反应

    截至2015年11月,移植后的中位随访时间为21(9至34)个月,中位生存时间为18(9至31)个月,中位生存时间为10.5(4至20)个月。 CIK的中位数输注次数为3次(2至8次),直到MRD阴性或形态学复发并停止输注。一例输注无效两次,MRD继续为阳性,最终形态学死亡。在9例患者中,MRD阴性,评估有效。一名患者在10个月后死于复发,一名患者在免疫抑制剂再次使MRD阳性降低后,严重GVHD死亡,另7例患者没有疾病存活。 CIK输注后的中位随访时间为10(3至14)个月,中位生存时间为8(3至14)个月,中位无病生存时间为8(0至14)个月。其中5例患者输注CIK后的无病生存期长于移植后的无病生存期。

    3讨论

    异基因造血干细胞移植后复发是治疗失败的主要原因,预后极差。移植后mrd患者有很高的形态学复发风险。kroger等研究表明,急性白血病患者异基因造血干细胞移植后mrd阳性,复发率为25%~90%。因此,定期监测allo-hsct术后mrd,减少免疫抑制剂、dli等,提高移植物的抗白血病作用,阻止复发进展,具有重要意义。然而,aml患者和所有allo-hsct复发后停用免疫抑制剂的患者的缓解率较低,gvhd风险较高。dli是一种主要的治疗策略,已被证明对血液系统恶性肿瘤复发患者有效,对cml复发患者疗效最好,其次是aml,但对all等淋巴系统恶性肿瘤患者疗效较差。这种被动免疫疗法能产生显著的毒性。急性移植物抗宿主病(gvhd)和骨髓增生异常是治疗后高死亡率的主要原因,在一定程度上限制了dli的临床应用。

    CIK细胞是一组体外扩增的CD3 + T细胞,但也有NK细胞标记物,例如CD56 +和NKG2D,因此将T淋巴细胞的强抗肿瘤活性与NK细胞的非MHC限制性杀伤特性相结合。研究表明,CIK细胞可以多种方式杀死肿瘤细胞,并且可能不会产生类似于供体淋巴细胞输注的严重GVHD。近年来,一些学者研究了CIK细胞在动物骨髓移植模型中的作用。结果表明,CIK细胞在体内具有明显的抗肿瘤活性,并且移植物抗宿主病(GVHD)较轻,表明移植后的维持治疗。方面具有良好的应用前景。 Chen Lin等分析了11例接受allo-HSCT和CIK细胞输注的血液系统恶性肿瘤患者。治疗后,原发性肿瘤完全缓解,移植后2至4个月复发4例,其中3例复发。 CIK输注并终止免疫抑制剂后,供体完全缓解,治疗后中位生存时间为9(2至53)个月。 Laport等人治疗了18例CIK细胞移植后复发的患者,仅2例I至II级aGVHD和1例局部cGVHD的患者。 5例患者输注CIK后的缓解期比同种异体造血干细胞移植后的缓解期更长。这表明CIK细胞耐受性好,诱导GVHD的风险低,并且对高危患者的移植物抗白血病(GVL)具有保护作用。

    目前,大多数中心在移植后mrd呈阳性时,可通过迅速减少免疫抑制剂或预防性dli而再次达到分子生物学缓解。本研究中的10例患者大多有复发和难治性原发性疾病,移植后均达到分子生物学缓解。然而,移植后复发的风险很高。预计将定期监测mrd。在分子生物学和形态学复发后,经免疫抑制剂、dli、化疗或化疗加dli治疗后,形态学完全缓解,mrd呈阳性。考虑到持续的dli治疗可能导致严重的gvhd,特别是在单倍体移植患者中,严重gvhd的发生率更高,因此尝试供体型cik细胞治疗。治疗后大多数患者无病生存时间长,复发率明显低于文献报道。1例为异基因干细胞移植后形态学复发,国内外报道为难治性病例。虽然在停用免疫抑制剂后完全缓解,但原始粒细胞的比例仍然很高。分子生物学缓解只能通过简单的输注cik细胞来实现,但在免疫抑制剂停药前没有发生。并发症明显,cik治疗有效、安全。但3个月后mrd再次呈阳性,提示cik细胞作用时间短,需要反复输注。我们的研究还提示,供者cik细胞输注有助于延长异基因干细胞移植后无病生存时间,降低血液学复发率,但病例数少,其疗效仍需进一步验证;另一例无效。估计与肿瘤细胞负荷过大有关。在这项研究中,两名患者在最初输注cik细胞3至4小时后出现寒战和发热,这可能与细胞溶胶中存在il-2等细胞因子有关,并且在对症治疗后,所有患者都有所改善。

    这项研究表明,尽管有些患者在输注CIK细胞后出现了GVHD,但其程度较轻,经治疗后很快消失。因此,异基因造血干细胞移植后复发患者的MRD仍为阳性,为高危人群血液肿瘤移植后体外注入供体CIK细胞以预防复发是可行的。总之,CIK细胞具有小的不良反应,安全性和患者耐受性。因此,它们被广泛用于肿瘤化疗,以进一步消除MRD,降低血液学复发率,并成为造血干细胞移植后维持治疗的理想选择。然而,由于本研究中的病例较少,因此没有分析CIK治疗的有效性在肿瘤疾病分类,风险分层,移植后形态学复发和分子生物学复发之间的差异,但长期随访-向上观察显示效果良好。可以进一步扩大病例数,并可以延长随访时间以观察疗效。

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